参考文献

1.Katz, L.C., Burkhalter, A., and Dreyer, W.D. Fluorescent latex microspheres as a retrograde neuronal marker for in vivo and in vitro studies of visual cortex. Nature 310: 498-500 (1984).

2.Katz, L.C. and Iarovici, D.M. Green fluorescent latex microspheres: a new retrograde tracer. Neuroscience 34: 511-520 (1990). 

实验方案

Red Retrobeads IX红色荧光微粒实验Protocol：Protocols for Use of Fluorescent Latex Microspheres （Rev. 11/09）

RetroBeads™逆向示踪荧光微粒是Lumafluor 公司特色的逆向示踪产品，且是目前文献证实有效的示踪微粒（该产品的有效性经数百篇从无脊椎动物到哺乳动物实验的研究论文证实），  该示踪产品体内注射高度集中不易扩散，信号强，对活细胞或活体无毒，且存留时间大于一年，与大多顺向示踪剂、原位杂交检测技术、免疫组化技术兼容。

Lumafluor红色 Red RetroBeads操作说明

一、包装与稀释：

   Lumafluor 的beads包装于一支密封的小管内，内含的浓缩beads悬浮于蒸馏水中。如使用红色Beads作为神经通路的逆向示踪，其稀释方法推荐采用：大鼠视皮层内可采用1：4比例进行稀释而不减少Beads的荧光标记强度和质量。然而对于实验我们不推荐使用稀释的Beads而使用原液进行注射示踪。除蒸馏水外，常规的盐溶液如NaCl、KCl溶液也可作为稀释液。如使用绿色Beads，则强烈建议使用原液，无需稀释。

二、温度储存: 

    为避免蒸发，Bead溶液应存放于冰箱内4度冷藏，切忌勿冷冻！ 冷冻的Beads将失去效用，无法使用。而变干的beads同样也无法使用（无法重悬），该产品建议一年内用完。 

三、注射：

    Beads使用压力注射，如1 mlHamilton微量注射器或气压注射系统，如需小区域微量注射(30-50 nl)，可采用末端30-50 um直径的玻璃电极注射，而常规的逆向示踪（注射量0.1-0.3 ul）可使用更大直径的玻璃电极。尽管如此，即使注入更大的剂量，Beads，也不会明显从注射位点扩散（通常扩散距离少于1mm），因此，为尽量完全标记投射到一个较大神经核团的神经元，需使用多点注射。尽管Beads带有负电荷，但是不建议采用离子渗透法注入示踪Beads。

四、存活时间：

    在大多数恒温脊椎动物系统中，检测Beads的时间推荐为1周。目前并未检测Beads的zui长可检测期，然而在Beads的荧光强度和质量至少可保持在体内14个月以上不变，而细胞可能会被yongjiu标记。目前并未发现Beads在动物或神经元中表现出毒性作用的报道。

五、固定和处理：

    准的固定方法是：0.1 M PBS冲洗或灌注后在4%的多聚甲醛（0.1 M PBS配制，pH 7.4）中固定，用戊二醛固定会产生大量的组织自发荧光，妨碍Beads标记的神经元，并且绿色Beads在戊二醛固定的组织中将完全观察不到，因此应尽量避免采用。如采用冰冻切片，切片应用PBS漂洗后用明胶包被的载玻片贴片晾干，在完全风干后，再用二甲苯透明1分钟，然后用荧光封片剂（Fluoromount或Krystalon）封片。Fluoromount可从Atomergic Chemetals Corp., （Farmingdale, NY）公司购买; Krystalon可从Harleco (EM Industries，Gibbstown, NJ）购买（靶点科技有售）。切片只可短期暴露在乙醇或二甲苯中，但是长时间暴露（大于5分钟）会损坏Beads。Beads 对甘油非常敏感，在甘油环境中荧光会迅速萃灭，因此切忌使用甘油类封片剂，如无法避免，还可采用水杨酸甲酯代替甘油作为封片剂。封片后的切片如存放于黑暗环境中，荧光Beads标记的细胞可保持一年不萃灭（但是切片的自身荧光背景会增加）。迄今为止，还没有成功采用塑胶材料包被Beads标记的组织的记录。

六、成像观察:

    红色Beads中的染料为罗丹明，因此所有与罗丹明匹配的荧光滤镜均可使用，部分老的尼康公司的罗丹明滤镜因背景较高，可能导致无法观察到荧光Beads，通常Zeiss 和Leitz的标准罗丹明滤镜可获得较好的观察效果。而大多绿色荧光滤镜均可较好地观察绿色Beads的荧光结果，设置为荧光黄的滤镜可获得较强的明亮荧光，但是同时也带来较高的背景干扰。较宽波段的荧光滤镜比窄波段的荧光滤镜可以获得更强的荧光信号。在长时间的观察和拍照下Beads的荧光也不会淬灭。

  在低倍数或低数值孔径物镜下(如 X4, X10)通常难以观察到Bads的荧光信号，只有细胞被显著标记，X10的油镜（数值孔径大于0.4）或者更大倍数的物镜才可观察到。通常情况下，X 25的油镜可以清晰地观察到低倍镜下无法观察到的标记细胞。物镜的选用对绿色荧光Beads尤其重要。在做出实验失败的决定前（在目标区域无法观察到标记细胞），可先用油镜仔细观察注射位点附近的细胞是否被标记，此处应该观察到大量的标记细胞。

   对使用绿色荧光Beads标记的额外提醒：目前已发现绿色荧光Beads在年青动物比年老动物中标记更为理想的情况，此外，年青动物的组织自发荧光（背景）也更低，因此，假如可以的话，在使用绿色荧光Beads做逆向标记实验时请尽量使用年轻动物。

   因为绿色荧光Beads的激发光段比红色荧光Beads短，因此组织自发荧光是个问题，因此，应采用减少自发荧光的步骤以获得更理想的实验结果，这些方法有：（1）使用更薄的切片，如30微米比40或50微米理想；（2）使用年青的动物；（3）封片后立即观察拍照（随着时间增加背景也会增加）。